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手性色譜柱（Chiral HPLC Columns）是由具有光學(xué)活性的單體，固定在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相（Chiral Stationary Phases）。通過引入手性環(huán)境使對映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特征的差異，從而達(dá)到光學(xué)異構(gòu)體拆分的目的。要實(shí)現(xiàn)手性識別，手性化合物分子與手性固定相之間至少存在三種相互作用。這種相互作用包括氫鍵、偶級-偶級作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用。手性分離效果是多種相互作用共同作用的結(jié)果。這些相互作用通過影響包埋復(fù)合物的形成，特殊位點(diǎn)與分析物的鍵合等而改變手性分離結(jié)果。由于這種作用力較微弱，因此需要仔細(xì)調(diào)節(jié)、優(yōu)化流動相和溫度以達(dá)到*分離效果。 在手性拆分中，溫度的影響是很顯著的。低溫增加手性識別能力，但可能引起色譜峰變寬而導(dǎo)致分離變差。因此確定手性分析方法過程中要考慮柱溫的影響，確定*柱溫。迄今為止，尚沒有一種類似十八烷基鍵合硅膠（ODS）柱的普遍適用的手性柱。不同化學(xué)性質(zhì)的異構(gòu)體不得不采用不同類型的手性柱，而市售的手性色譜柱通常價格昂貴，因此如何根據(jù)化合物的分子結(jié)構(gòu)選擇適用的手性色譜柱是非常重要的。
根據(jù)手性固定相和溶劑的相互作用機(jī)制，可提出手性色譜柱的分類體系：
第1類：通過氫鍵、π-π作用、偶級-偶級作用形成復(fù)合物。
第2類：既有類型1中的相互作用，又存在包埋復(fù)合物。此類手性色譜柱中典型的是由纖維素及其衍生物制成的手性色譜柱。
第3類：基于溶劑進(jìn)入手性空穴形成包埋復(fù)合物。這類手性色譜柱中zui典型的是環(huán)糊精型手性柱，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）形成的手性色譜柱也屬于此類。
第4類：基于形成非對映體的金屬絡(luò)合物，也稱為手性配位交換色譜（CLEC）。
第5類：蛋白質(zhì)型手性色譜柱。手性分離是基于疏水相互作用和極性相互作用實(shí)現(xiàn)。 根據(jù)固定相的化學(xué)結(jié)構(gòu)，將手性色譜柱分為以下幾種：
● 刷（Brush）型或稱為Prikle型
● 纖維素（Cellulose）型
● 環(huán)糊精（Cyclodextrin）型
● 大環(huán)抗生素（Macrocyclic antibiotics）型
● 蛋白質(zhì)（Protein）型
● 配位交換（|Ligand exchange）型
● 冠醚（Crown ethers）型
1 刷型：
應(yīng)用范圍較廣、柱效很好的手性色譜柱。
刷型手性色譜柱是根據(jù)三點(diǎn)識別模式設(shè)計(jì)的，刷型手性固定相分為 π 電子接受型和 π 電子提供型兩類。
zui常見的 π 電子接受型固定相是由（ R ） -N-3 ， 5- *甲酰苯基甘氨酸鍵合到 γ- 氨丙基硅膠上的制成。此類刷型手性色譜柱可以分離許多可提供 π 電子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等對化合物進(jìn)行衍生化后進(jìn)行手性分離。 π 電子供給型固定相常見的是共價結(jié)合到硅膠上的萘基氨基酸衍生物，這種固定相要求被分析物具有 π 電子接受基團(tuán)，例如*甲酰基。醇類、羧酸類、胺類等，可以用氯化*甲酰、異腈酸鹽、或*胺等進(jìn)行衍生化后，用 π 電子供給型固定相達(dá)到手性分離。
刷型固定相的優(yōu)勢在于其易于合成。另外，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的選擇因子。它的不利之處在于它僅對芳香族化合物有效，有時不得不進(jìn)行衍生化反應(yīng)。這種衍生化反應(yīng)是非手性衍生反應(yīng)，所以不存在手性衍生的問題。刷型手性色譜使用的流動相基本是極性弱的有機(jī)溶劑，這對于制備色譜來講未必是缺點(diǎn)。
近來，刷型固定相出現(xiàn)了 π 電子供給和接受基因的混合固定相。十分適用于 β- 阻斷劑的手性分離。典型的流動相為二氯甲烷 - 乙醇 - 甲醇混合物，比例為 85 ： 10 ： 5 。加入 10mM 醋酸銨可以調(diào)整保留時間。同時具有 π 電子供體區(qū)和受體區(qū)，形成手性裂縫，因此對于某些分子具有很高選擇性。
2 纖維素型：
纖維素型手性色譜柱的分離作用包括相互吸引的作用及形成包埋復(fù)合物。它們屬于分類中的第 2 種類型。市售的手性色譜柱為微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基氨基酸鹽纖維素固定相。很多化合物可通過此類型的色譜柱得到分離。這種類型的手性色譜柱種類也很齊全。流動相使用低極性溶劑，典型的流動相為乙醇 - 己烷混合物。但特別要注意由于氯可以使纖維素從硅膠上脫落，因此要確保流動相中無含氯溶劑。
這種類型的手性色譜柱主要的制造商之一是日本的 Daicel 公司，他們生產(chǎn)的纖維素酯和氨基甲酸纖維素柱可以分離多種生物堿和藥物。特別值得一提的是 OD 柱。在某手性化合物異構(gòu)體的分離中，分離度超過了 25 ，這意味著載樣量可以很高，對于制備十分有利。纖維素固定相的每個單元都為螺旋型，而且這種螺旋結(jié)構(gòu)還存在極性作用、 π-π 作用及形成包埋復(fù)合物等手性分離因素。淀粉代替纖維素制成的此類手性柱顯示了和纖維素柱不同的選擇性，但是穩(wěn)定性較差。因?yàn)榈矸凼撬苄缘模虼肆鲃酉嘀斜仨殶o水才能保證柱子壽命。目前此類型的柱子能分離 80% 左右可能面臨到的所有手性化合物。此類柱子通常用于正相系統(tǒng)，用正己烷 - 乙醇，正己烷 - 異丙醇混合溶劑為流動相。 OD 柱也可用于反相的情況，但流動相必須含有高濃度的高氯酸鹽緩沖液，以防止固定相溶解。即使這樣，使用較長時間以后色譜柱也難免要受到損害，但是在某些情況下使用反相系統(tǒng)分離效果要優(yōu)于使用正相系統(tǒng)。
3 環(huán)糊精型
基于溶劑進(jìn)入手性空穴形成包埋復(fù)合物。這類手性色譜柱中zui典型的是環(huán)糊精型手性柱，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）形成的手性色譜柱也屬于此類。
環(huán)糊精是通過淀粉酶或環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶水解淀粉得到的環(huán)型低聚糖。通過控制環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶的水解反應(yīng)條件可得到不同尺寸的環(huán)糊精。市售的環(huán)糊精主要是 α 、 β 、 γ 三種類型，分別含 6 、 7 、 8 個吡喃葡萄糖單元。環(huán)糊精分子成錐筒型，構(gòu)成一個洞穴，洞穴的孔徑由構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖的數(shù)目決定。2 ， 3 位仲羥基分布在環(huán)糊精洞口， 6 位伯羥基在環(huán)糊精分子的外部，這意味著洞穴內(nèi)部是相對疏水的區(qū)域。用環(huán)糊精手性固定相產(chǎn)生手性識別要求被拆分物的疏水部分能嵌入環(huán)糊精洞穴中，形成可逆的、穩(wěn)定性不同的包合物，環(huán)糊精洞口的羥基和被拆分物的極性基團(tuán)相互作用。由于形成包合物速度較慢，因此可能導(dǎo)致色譜峰峰形較差，同樣也影響了其在制備色譜中的應(yīng)用。環(huán)糊精固定相的選擇性取決分析物的分子大小； α- 環(huán)糊精只能允許單苯基或萘基進(jìn)入， β- 環(huán)糊精允許萘基及多取代的苯基進(jìn)入， γ- 環(huán)糊精僅用于大分子萜類。 β- 環(huán)糊精手性固定相應(yīng)用范圍zui廣。布洛芬通過 β- 環(huán)糊精色譜柱得到分離，說明了 pH 值對氫鍵的影響。當(dāng)流動相的 pH=7 時，觀察不到拆分的跡象。 pH=4 時，可達(dá)到好的分離效果。通常分離氨基酸時，常采用低的 pH 值，以抑制酸性基團(tuán)的離子化，同時也增強(qiáng)氨基的質(zhì)子化。磷酸三乙胺鹽、乙酸三乙胺鹽證明對 β- 環(huán)糊精色譜柱來說是很好的緩沖液。通常緩沖液是 0.1% 三乙胺溶液，用磷酸或醋酸調(diào)節(jié)到合適的 pH 值。高的流速會降低形成復(fù)合物的能力，低流速分離效果較好， 0.5-1ml/min 的流速。另外，增加緩沖液的濃度可以克服流速的影響，因?yàn)樗梢栽黾迎h(huán)糊精洞穴和流動相的吸引力。
常用緩沖液及其使用濃度如下表所示：優(yōu)化手性分離條件要考慮的方面有： pH 值對分離度的影響；流速對分離度的影響；柱溫、有機(jī)相比例、緩沖鹽濃度對分離度的影響。 環(huán)糊精的修飾：zui近，對環(huán)糊精的修飾使環(huán)糊精型手性色譜柱可以分離更多的化合物，并可用于氣相手性色譜分離。衍生化是通過將不同的基因鍵合到環(huán)糊精洞穴表面的羥基上。衍生化反應(yīng)包括乙基化、 S- 羥基丙基化、生成 S 或 R- 萘基乙基氨基甲酸鹽、 3 ， 5 二甲基苯基氨基甲酸鹽和環(huán)狀對甲苯酰酯。這些新型的環(huán)糊精固定相有許多優(yōu)點(diǎn)，它們可以分離更多化合物，價格上也有競爭力，由于改進(jìn)了手性識別能力使其更適用于制備色譜。
4 配位交換型：
手性配位交換色譜（ Chiral Ligand Exchange Chromatography ， CLEC ）是通過形成光學(xué)活性的金屬絡(luò)合物而達(dá)到手性分離，分類中的第 4 類手性固定相，主要用于分離氨基酸類。分離乳酸類的化合物效果也很好。由于此類固定相是由手性氨基酸 — 銅離子絡(luò)合物鍵合到硅膠或聚合物上形成，因此流動相中必須含有銅離子以保證手性固定相上的銅離子不至流失。其它的過渡金屬元素也已用于手性配位交換色譜，但銅離子應(yīng)用zui廣。由于形成絡(luò)合物的過程十分緩慢，因此有時需提高柱溫，*溫度約 50℃ 。
手性配位交換色譜僅對 α- 氨基酸和其類似物有效。 β- 氨基酸很難用手性配位交換色譜得以分離。手性配位交換色譜可用于制備，由于流動相中存在銅離子，雖然銅離子能用離子交換柱除去，但增加了樣品處理的困難。
5 大環(huán)抗生素型：
大環(huán)抗生素型手性色譜柱是zui近發(fā)展起來的，通過將大環(huán)抗生素鍵合到硅膠上制成的新型手性色譜柱。此類色譜柱常用的大環(huán)抗生素主要由三種：利福霉素（ Rifamycin ），萬古霉素（ Vancomycin ），替考拉寧（ Ticoplanin ）。利福霉素作為手性添加劑在毛細(xì)管電泳分離手性化合物方面得到了成功運(yùn)用。萬古霉素和替考拉寧分子結(jié)構(gòu)中存在 “ 杯 ” 狀結(jié)構(gòu)區(qū)和糖 “ 平面 ” 結(jié)構(gòu)區(qū)。此類色譜柱性質(zhì)穩(wěn)定，可用于多種分離模式。手性分離基于氫鍵、 π-π 作用、形成包合物、離子作用和肽鍵等。萬古霉素分子量為 1449 ，結(jié)構(gòu)中存在 18 個手性中心， 3 個環(huán)。萬古霉素具有 “ 籃狀 ” 結(jié)構(gòu)，它的附近還有一個可彎曲的糖平面，可將分析物分子包埋在 “ 籃子 ” 中。羧基和仲氨基分布在 “ 籃子 ” 的邊緣，參與和分析物分子產(chǎn)生離子作用。萬古霉素手性色譜柱可用于反相模式、正相模式和極性模式。萬古霉素手性色譜柱可以分離胺類、中性酰胺、脂類。但對于酸性化合物選擇性較低。在反相模式中，有機(jī)相常用四氫呋喃、乙腈和甲醇。水相常用三乙胺 - 乙酸緩沖液。色譜柱適用的 pH 范圍為 4-7 。通常優(yōu)化堿性化合物手性分離條件時，選擇 pH=7 為 起點(diǎn)比較好。另外四氫呋喃、乙腈有的選擇性。有時采用純的甲醇和乙醇作流動相也可達(dá)到好的分離效果。萬古霉素手性色譜柱也可用正相模式，采用正己烷 / 乙醇為流動相。 萬古霉素手性色譜柱載樣量可以很大，非常適用于制備色譜。
6 蛋白質(zhì)型：
蛋白質(zhì)型手性色譜柱屬于第 5 種類型。分離依賴于疏水相互作用和極性相互作用。已經(jīng)有多種蛋白質(zhì)用于此類手性色譜柱。目前使用較多的是 α- 酸性糖蛋白（ α-Acid Glycoprotein ， AGP ），人血清白蛋白（ Human Serum Albumin ， HSA ），牛血清白蛋白（ Bovine Serum Albumin ， BSA ）和卵類粘蛋白（ Ovomucoid ， OV ）。 α- 酸性糖蛋白分子由 181 個氨基酸殘基和 40 個唾液酸（ sialic acid ） 殘基構(gòu)成。 α- 酸性糖蛋白分子偏酸性，等電點(diǎn)為 2.7 。含有兩個二硫鍵，性質(zhì)很穩(wěn)定。 α- 酸性糖蛋白分子可以共價鍵合到硅膠上，制成手性色譜柱，可以分離許多化合物。 α- 酸性糖蛋白手性色譜柱使用的流動相通常為 pH 4-7 的磷酸鹽緩沖液和很小比例的有機(jī)相。有機(jī)相異丙醇，如達(dá)不到分離要求，可以嘗試乙腈，乙醇，甲醇或四氫呋喃。有機(jī)相的改變導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生暫時的改變。色譜柱的負(fù)載量至關(guān)重要，典型的負(fù)載量為 0.02mg/ml 的濃度樣品，進(jìn)樣 20μl 。 pH 的改變對手性選擇性起關(guān)鍵作用，尤其是胺類化合物。 pH 降低導(dǎo)致蛋白質(zhì)負(fù)電荷的降低，引起胺類化合物保留時間減小，然而這意味著可以減小有機(jī)相比例，使選擇性增加，峰形改善。
通過調(diào)節(jié)有機(jī)相比例仍無法達(dá)到分離效果時，有時需用電荷調(diào)節(jié)劑。但這可能引起蛋白結(jié)構(gòu)的*改變，這些電荷調(diào)節(jié)劑包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。有時也用到 1 ， 2 亞乙基二醇， 1 ， 2 丁醇和氯化鈉。溫度對分離也有影響，溫度增加保留時間，減小分離因子。
人血清白蛋白（ HSA ）分子量為 69,000 ，等電點(diǎn)為 4.8 。蛋白中認(rèn)為存在兩個藥物結(jié)合位點(diǎn)：華法令 - 氮雜普魯帕宗（ warfarin-azapropazone ） 和苯基二氮雜 - 吲哚（ benzodiazapine-indole ）結(jié)合位點(diǎn)。流動相中加入辛酸，采用人血清白蛋白手性色譜柱可以有效分離 benzodiazapine 。 Warfarin 和 oxazepam 也用人血清白蛋白手性色譜柱得到了分離，流動相組成為： 100mM 磷酸緩沖液 pH7 ：乙腈：異丙醇 = 84 ： 10 ： 6 。 牛血清白蛋白（ BSA ）為球型蛋白，分子量為 66,000 ，等電點(diǎn)為 4.7 。此蛋白為一個單氨基酸鏈，通過 17 個二硫鍵形成 9 個雙環(huán)。許多化合物通過牛血清白蛋白手性色譜柱得到分離。牛血清白蛋白不如 α- 酸性糖蛋白穩(wěn)定，一些有機(jī)溶劑（如乙腈、甲醇）可使蛋白變性，因此使用起來要特別注意。
卵類粘蛋白由蛋清中提取，分子量為 55,000 。它可分離大量的胺類和酸類化合物。該柱的應(yīng)用比較廣。蛋白手性色譜柱在所有手性色譜柱中是應(yīng)用zui廣的色譜柱
7 冠醚型：
冠醚類固定相用于分離一級胺，一級胺必須質(zhì)子化方能達(dá)到分離。因此必須使用酸性流動相，如高氯酸。zui常用的是冠醚類固定相是 18- 冠 -6 ，已有商品化產(chǎn)品，由 Daicel 公司制造。無論（ + ）或（ - ）型均可達(dá)到有效分離，并可通過變化（ + ）（ - ）類型而改變分析物出峰順序。冠醚作為添加劑也用于核磁共振和電泳，但由于其毒性較大，有致癌性，使其應(yīng)用受到限制。
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